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免疫亲和纯化的操作步骤
阅读：2079 发布时间：2010-11-241．主要内容
纯化率为1000～10 000倍。
快速纯化抗原，层析柱?？芍馗词褂谩?/div>
可获得纯化的抗原。
不能用于定量测定。
纯化效果取决于抗原的浓度和抗体的亲和力
需要适当纯化的抗体。
2．操作步骤
（1）将抗体结合到蛋白A或蛋白G微珠上。对于一般用途的层析柱，每毫升湿的微珠大约可以结合2mg单克隆抗体或亲和纯化的多克隆抗体。将抗体和蛋白A或蛋白G微珠混合制成稀薄的匀浆，在总量为10ml的溶液中加入大约lml微珠，室温孵育1h，轻轻摇动混匀。
（2）用10倍体积的0．2mol／L硼酸钠（pH9．0）洗涤微珠2次，每次以3000g离心2rain或10 000g离心30s。
（3）用10倍体积的0．2mol／L硼酸钠（pH9．0）重悬微珠，留取相当于10t~l湿微珠的样品。加入足量的二甲基庚二酸酯（固体）至微珠匀浆中，使终浓度为20mmol／L。
（4）室温孵育30min，并轻轻混匀。留取相当于10t~l偶联微珠的样品。
（5）用0．2mol／L乙醇胺（pH8．0）洗涤微珠1次以终止反应。然后重悬于0。2mol／L乙醇胺，室温孵育2h，轻轻混匀。微珠用PBS洗涤后，重悬于PBS，加入硫柳汞保存。
（6）将偶联前和偶联后的微珠样品加入Laemmli样品缓冲液中煮沸后，检查偶联效果。分别取相当于1ul和9ul 2份样品在10％SDS—聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并用考马斯亮蓝染色，偶联效果良好时，在偶联前的微珠样品中显示一条55kDa的重链带，而偶联后的样品无此区带。
（7）将抗体包被的微珠转入合适的层析柱中，用PBS冲洗容器，收集残留的微珠。如果可能，仅使用结合制品中全部抗原所需的抗体微珠基质。
（8）用20倍柱床体积与制备抗原相同的缓冲液洗柱。
（9）将抗原液加到柱上，按每毫升柱体积大约lml／h的速度使抗原溶液流过层析柱，可以用一台蠕动泵控制。
（10）用20倍柱床体积的结合缓冲液（PBS）洗柱。
（11）用20倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱。建议使用预洗脱缓冲液。
（12）采用分段洗脱法，连续以0．5倍柱床体积的洗脱缓冲液通过层析柱，分管收集每一组分。如果用过高或过低pH值的缓冲液洗脱，收集管内需加入0。1倍柱床体积的缓冲液
（13）检测每管的抗原含量，将浓度高的各管合并。根据抗原的用途，需对获得的蛋白洗脱液透析以改变缓冲液。
（14）用20倍柱床体积的起始缓冲液流经基质，使层析柱再生。加入0．01％硫柳汞可长期保存（4℃）。