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基因片段表达作图法
阅读：973 发布时间：2010-11-24 已有许多方法，包括已商品化的试剂盒（Novatope），被用来在一个表达载体系统中进行随机的或特定的开放阅读框基因片段的表达。然后测定基因片段库与特定抗体的反应性，并进行作图。与抗体结合的基因片段序列特性，可以通过测序分析证实。在许多实验中，研究者可事先将所研究的基因片段库克隆在表达载体中。其中的基因片段可能是不完整的cDNA片段，所有这些片段均可以通过简单的免疫化学方法鉴定其中是否存在有相关的抗原表位。如果抗体与目的抗原在免疫印迹中具有较强的反应，说明可采用同样的方法分析任一表达的基因片段。
如果某些抗体在免疫印迹试验中与基因片段编码的蛋白质不发生反应，仍然可以将此类抗体标记后对细菌克隆直接进行印迹分析。例如，在直接印迹分析中，所有针对SV40大T抗原的单克隆抗体与基因片段编码的蛋白质不发生反应，但仍然可以通过测定其与p—半乳糖苷酶的融合蛋白反应进行表位作图。因此，许多容易变性的抗原表位可以用此法进行作图。
如果在一个表达载体中没有建立基因片段的文库。那么，表位作图时建立基因文库是首要目标。对此建议选择一种快速、简单、适用的方法，且不必进一步克隆和测序；而且有机会对易变性的蛋白表位作图，至少是部分作图。
一个的选择是基于PCR表达原理，因为设计的PCR产物在体外可有效表达，并与有关体外转录和翻译的关键DNA调节原件相协调。为了检查人类基因性疾病，如APC和BRCA2，已广泛使用检测影响蛋白质合成的截断性突变。亦有许多，其关键的试剂盒也可获得。
采用PCR产物表达方法可以扩增一系列的已经确定的基因片段，并可以进一步利用体外转录和翻译试剂盒将其在体外表达。此法并不需要在原来克隆基础上进行亚克隆，因为PCR产物本身可以作为转录和翻译的模板在体外进行表达。但是，这也意味着PCR过程中所产生的序列错误将不可能在克隆过程中排除。体外翻译过程中对蛋白产物进行标记，有助于采用直接免疫沉淀法分析与抗体反应的片段。
该方法的目的是利用PCR产生一系列线性DNA片段，其中包括体外转录所必需的启动子和体外翻译过程所必需的各类调节信号。这些DNA片段实际包括了原始基因开放阅读框的氨基和羧基末端重叠的基因片段序列。这些线状DNA产物可以直接作为模板在体外进行翻译表达。利用放射性标记的氨基酸掺入体外翻译反应，可以用免疫沉淀方法对蛋白质进行鉴定和分析。较之分析前须对每一产物进行克隆的表达方法，该方法有其显著的优点。在这种方法中，蛋白质体外翻译所产生的是可溶性蛋白，而且其折叠形式是与自然状态相一致。
蛋白质片段的羧基末端产生很容易，因为，这里不需要对蛋白的氨基末端或启动子元件进行任何的修饰，5，端引物应保证PCR产物含有完整的启动子元件。相反，3，端反义引物系列将决定蛋白质片段新的末端。
从氨基末端产生一系列蛋白片段则较困难，因为必需保留蛋白质转录和翻译过程中所涉及的5’端各类启动子和翻译信号。要保证体外转录和翻译，可以采用通用的启动子元件，其中含有转录和翻译所必需的信号，如RNA聚合酶结合位点，不翻译的前导信号序列，Kozak序列和翻译起始密码子。这些通用启动元件可以和任何一种开放阅读框结合，这些PCR产物可用一种技术将相互末端重叠的DNA片段进行拼接，此法也称为重叠延伸拼接法（splicingby overlap extension，SOE）。这种拼接反应可以产生一种融合产物，将体外转录和翻译过程所需的所有元件都包括在内，使得转录和翻译可在开放阅读框中选择特定位点进行（Kain et a1．1991；Burch et a1．1993；Tropak and Roder1994；FarlyandLong 1995）。
35S甲硫氨酸标记的翻译产物，可以用免疫沉淀和凝胶电泳进行分析。
对任何表位作图的结果分析，仅选用阳性反应的蛋白片段进行预测。缺少与特定蛋白片段阳性反应，并不能说明该表位不包括在蛋白片段内，因为，蛋白质局部的折叠可能使表位被掩盖。虽然这是在对某些构象依赖性表位作图时常遇到的问题，但在所有情况下都应该遵守这个原则。
如果由于体外转录和翻译的表达试剂盒花费太大，或者因为使用同位素受到限制，另外一种可选择的方法是采用PCR方法将一段已知片段的开放阅读框克隆至一种简单的、但是能够表达的细菌表达载体中。使用能够使表达片段产生基因融合的载体，如含有谷胱甘肽S—转移酶（GST）基因、或者p—半乳糖苷酶基因的载体。上述2种载体均能产生大量的融合蛋白，而且，载体中含有合适的限制性酶切位点。这些酶切位点可以在调整表达片段开放阅读框时，配合PCR引物序列进行有效的调节。这些融合蛋白可以直接使用表达融合蛋白的细菌进行克隆，或者以该细菌细胞提取液进行蛋白免疫印迹法检测。