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生物素标记肽的检测方法
阅读：1957 发布时间：2010-11-24 1．准备工作
该检测是在96孔微板上进行，每孔均先用链霉亲合素包被，分别依次加入待进行表位作图的肽系列，并用需定位的抗体检测。
2．试剂和溶液
0．1％PBS-Tween；
2％BsA／PBS；
0．1％（wt／v01）BSA／PBS；
肽；
过氧化物酶标记的第二抗体；
TMB底物（取50／xl 50g／LTMB储存液，加入5ml 0．1m01醋酸钠，pH 6．6，另加1ul过氧化氢）；
100 btmol硫酸。
3．操作步骤
（1）干肽溶于100％DMSO中，使其贮存液的浓度为10mg／m1，工作液的终浓度为lmg／ml，贮存于—70℃。
（2）用5／Ig／m1链霉亲和素（去离子水稀释）包被96孔板每孔50pl，注意设立复孔。37℃孵育过夜。
（3）用0．1％PBS-T洗板4次，用2％BSA／PBS封闭非特异性结合位点，室温2h。用0．1％PBS-Tween洗涤。 ．
（4）将肽用0．1％（重量／体积）BSA／PBS稀释至终浓度为5／（g／m1（用工作原液的1／200稀释），每孔加入50txl肽溶液，湿盒置室温孵育2h或者过夜。
（5）从孔中吸去肽，并用0．1％PBS-T洗板4次。
（6）加入待测抗体。如用杂交瘤细胞培养上清液，可用原液或稀释1／10倍（用0．1％PBS-T）稀释。多克隆血清应稀释至1／200—1／2000进行试验，而纯化抗体应该在1—10bg／ml。
（7）孵育2h或过夜，吸去抗体溶液，用0．1％PBS-T洗板4次。然后加入过氧化物酶标记的二抗（兔抗鼠IgG单克隆抗体，用5％FCS／PBS作1／1000稀释），室温孵育2h。
（8）洗板4次，加入TMB底物，每孔50／J1，即50ml（50g／L）TBM储备液中加入5ml醋酸钠pH6．6及lml过氧化氢。
（9）出现蓝色时，加入lOOmmol／L硫酸50／1l终止反应。在450nm波长下测其OD值。
在一个成功的实验中，一系列肽根据表位的大小以及所选择肽的重叠程度，其中1个、2个或者3个肽可以得到强阳性的信号。例如，一个长度为15个氨基酸的肽链，有5个氨基酸重叠，那么，有些抗体可以与定位于5个氨基酸中的3个肽结合即产生强阳性信号。相反，另外一些抗体，与位于10个氨基酸表位中的2个肽结合产生阳性信号。某些抗体（极少数）仅对整条肽链显示1个阳性信号。这就意味着，氨基酸对于表位是至关重要的，常常定位于抗原的15个氨基酸区域中。
如果其他肽的背景染色很浅，可以认为就是很好的内在对照。一般而言，阳性肽不加试验性一抗，仅加检测试剂，应没有任何特异性信号。如果需要的话，表位分析可以通过氨基酸替换新的肽系列进行试验，一般使用丙氨酸（alanine）进行每一氨基酸位点的替换（在某些情况下，亦可以替换其他19个氨基酸）、转位替换一段肽或者重复氨基酸片段。