酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA之顯色與比色

    在目前的以HRP作為標記酶的商品ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應用液；如以OPD為底物，則試劑盒提供OPD片劑或粉劑，臨用前配制。一般商品試劑盒顯色反應條件為37℃或室溫反應15～30min。從理論上說，37℃30min才可以使HRP的底物催化反應*，盡管在zui初的10min內(nèi)，絕大部分催化反應即可完成。因此，為使弱陽性樣本孔能有充分的顯色，建議在37℃下反應25～30min后，終止反應比色測定。

    此外，在加入底物開始顯色反應前，是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加1滴于清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現(xiàn)，如有，則說明底物已變質。以OPD為底物，配好后應為五色，否則就不能使用。以TMB為底物，整個顯色反應過程無需避光，而以OPD為底物，則需避光進行。關于TMB和OPD的顯色反應特點及注意點可參考前面有關章節(jié)內(nèi)容。顯色反應完成后，加入酸終止反應，振蕩混勻后即可進行下面的比色測定或肉眼判斷結果。

    ELISA的比色測定由酶標儀進行。有的同行可能會認為，既然由酶標儀進行，那么此時便可以萬事大吉了，其實不然，因為當代較為*的酶標儀，均有較多的功能，使用不當，會得到令人難以理解的結果。如使用酶標儀比色測定后，有許多的陰性測定孑L的吸光度值為負數(shù)；或測定假陽性率大大增加等等。這主要是沒有正確地理解和使用酶標儀所致。

    1．比色測定時，一定要注意酶標儀的波長是否已調至合適或所用濾光片是否正確。由于有的臨床實驗室在進行ELISA測定時，以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯用的問題。

    2．單波長或雙波長比色選擇的問題。中檔以上的酶標儀基本上都同時具有單波長和雙波長比色功能。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有zui大吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定；而雙波長比色則是酶標儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定1次，敏感波長下的吸光度測定值為樣本測定酶反應特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。

    zui后酶標儀給出的數(shù)值為敏感波長下的吸光度值與非敏感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優(yōu)點，一般不必設空白孔。如在使用雙波長比色時，仍設空白孔，就可能會造成前面提到的測定孔吸光度為負數(shù)的現(xiàn)象。由于ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收具有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，是使用雙波長比色。

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