那么下面上海金鹏分析仪器有限公司为大家简单介绍一下磷酸化蛋白WB太难了，踩坑无数后我们总结了这7条：
蛋白磷酸化，是蛋白激酶在靶蛋白的氨基酸残基上添加磷酸基团的一种可逆的翻译后修饰，也是信号转导研究绕不开的话题。
WB 难，一入 WB 深似海，磷酸化蛋白的 WB 检测更是难上加难！因为一旦细胞裂解，就会释放出蛋白酶和磷酸酶，可以降解或修饰蛋白质，从而影响检测结果。怎么搞定？别急，告诉你 7 个小妙招：
① 将样品置于冰上，使用预冷的缓冲液
样品处理中使用的设备或缓冲液应在冰上（4 ℃）冷藏保存。尽可能使用预冷的试剂和设备，可以减缓去磷酸化、蛋白水解和变性。
② 使用磷酸酶抑制剂
在裂解缓冲液中加入磷酸酶抑制剂，否则轻者条带不明显，重者没有条带。*好是添加新鲜配制的蛋白酶-磷酸酶抑制剂混和物。
③ 将样品储存在上样缓冲液（loading buffer）中
蛋白定量后，将样品与上样缓冲液混合，遏制磷酸酶活性。随后可以将样本等分并储存在冰箱中或加载到凝胶上。
④ 避免使用牛奶作为封闭剂
牛奶中含有大量的一种磷蛋白——酪蛋白，会引起高背景。建议使用牛血清白蛋白BSA或无蛋白的封闭剂。
⑤ 使用无磷酸盐缓冲液
为尽量减少非特异性信号，用 TBST 代替磷酸盐缓冲液（PBS）。如果在中间步骤中必须使用 PBS，则应在加入蛋白检测底物前，用大量 TBST 清洗膜，以除去过量的磷酸钠。
⑥ 使用灵敏的底物进行化学发光检测
如需检测一种弱磷酸化的低丰度蛋白，可使用抗体对蛋白进行免*疫沉淀获得浓缩的蛋白，并在泳道中上样更多的蛋白，同时使用高灵敏度的底物进行化学发光检测。
⑦ 检测总蛋白含量
为确定 WB 上信号的缺失是由于磷酸化效率低还是磷酸化蛋白分离不充分，同时需要检测总蛋白含量。例如，使用配对抗体检测磷酸化和未修饰的蛋白。
总之，磷酸化蛋白的 WB 与非磷酸化蛋白基本相似，但在样品制备过程中必须谨慎操作，避免去磷酸化。
以上就是上海金鹏分析仪器有限公司为大家整理总结关于磷酸化蛋白WB太难了，踩坑无数后我们总结了这7条。
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