時下細(xì)胞研究很火的科研技術(shù)當(dāng)屬單細(xì)胞測序，但此技術(shù)對細(xì)胞懸浮液的總量以及活性都有一定的要求，因此制備高質(zhì)量的單細(xì)胞懸浮液成為實驗成功的關(guān)鍵點。

單細(xì)胞測序涉及的細(xì)胞類型多種多樣，如腸、肺、PBMC、胚胎、神經(jīng)、乳腺、干細(xì)胞等，而其中樣本的處理消化亦是重中之重，樣本前處理與后續(xù)的分析結(jié)果有著莫大的關(guān)聯(lián)。如何在上機前得到非常優(yōu)質(zhì)的懸液呢？這里和大家分享一些制備優(yōu)質(zhì)單細(xì)胞懸液的小tips。

1、在樣本采集過程中，建議采用無菌樣品處理方式，包括使用不含核酸酶的試劑和耗材；

2、實體組織需要先處理，傳統(tǒng)組織處理方法有機械法，包括網(wǎng)搓法、研磨法。機械法一般適用樣本類型為脾臟、淋巴結(jié)、胸腺；另外較溫和的方法有酶解法（使用胰蛋白酶類、膠原酶、溶菌酶、彈性蛋白酶以及一些商業(yè)化包裝的組合酶），適用樣本類型有肝臟、腎臟、心臟、肺臟、脊髓、腦、腸道、皮膚、腫瘤等。

3、如果您使用的是10x Genomics相關(guān)儀器和平臺，可以從查看10x Genomics不同樣本單細(xì)胞懸液制備建議或者利用關(guān)鍵詞查詢與自己樣本類型相同的已發(fā)表的單細(xì)胞測序文獻。對于如何獲得高質(zhì)量的樣品，10X公司建議在單細(xì)胞懸液制備過程中，細(xì)胞重懸的緩沖液選用無Ca2+、Mg2+和EDTA的1× PBS，并用0.04% non-acetylated BSA清洗兩次（300rcf，5min），選擇其他緩沖液或培養(yǎng)基可能會對結(jié)果產(chǎn)生不同程度的影響。

4、細(xì)胞在處理過程受到外界環(huán)境影響，其基因表達(dá)譜可能會出現(xiàn)一些變化；有些細(xì)胞對環(huán)境極為敏感，可能會死亡裂解，造成RNA降解從而造成檢測中的背景細(xì)胞升高，進而影響所獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量。實驗過程中需要盡量避免細(xì)胞死亡，不斷優(yōu)化細(xì)胞處理條件，加快實驗流程的進度，減小對細(xì)胞的影響。

5、單細(xì)胞懸液制備過程中出現(xiàn)的細(xì)胞團、細(xì)胞碎片或纖維等雜質(zhì)會增加微流體芯片的堵塞風(fēng)險。如果存在細(xì)胞碎片和大團塊，請將樣品通過 40 µm Flowmi 細(xì)胞過濾器，細(xì)胞懸液體積損失小。

圖源：10x Genomics 的Protocol《 Fresh Frozen Human Peripheral Blood Mononuclear Cells for Single Cell RNA Sequencing》

圖源：《10x Genomics®Single Cell Protocols——Cell Preparation Guide》

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