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利用厭氧培養(yǎng)箱在嚴格無氧條件下，完成食品基質(zhì)（如菜籽粕、乳制品等）或發(fā)酵菌種（乳酸菌、丁酸菌、丙酮丁醇梭菌等）的接種、培養(yǎng)和過程監(jiān)控，以獲得高活性、高純度的厭氧發(fā)酵產(chǎn)物。

一、實驗器材與試劑  

1. 厭氧培養(yǎng)箱（含傳遞箱、操作箱、恒溫箱、鈀催化劑、紫外燈）。  

2. 高純氮氣/CO?鋼瓶、減壓閥、氣體流量計。  

3. 培養(yǎng)基：MRS、強化梭菌培養(yǎng)基（RCM）、菜籽粕固態(tài)基質(zhì)等。  

4. 指示劑：美蘭指示條、氧化還原電位（Eh）電極。  

5. 其他：無菌培養(yǎng)皿、厭氧袋/罐（備用）、均質(zhì)器、電子天平、pH計。

二、標準操作步驟（SOP）

1. 箱內(nèi)環(huán)境建立 | ① 放入鈀粒+干燥劑；② 3 次抽真空-充氮循環(huán)（0.05–0.08 MPa）；③ 美蘭條不變藍即為厭氧合格。 | O? < 0.1 % | 每次開啟外門后必須重新置換。

2. 培養(yǎng)基及樣品傳入 | ① 關閉內(nèi)門→開外門→快速放入物品→關外門；② 啟動 2 次真空-充氮循環(huán)；③ 指示燈亮后開內(nèi)門，移入操作箱。 | 傳遞時間 < 30 s | 大體積固態(tài)基質(zhì)應分裝淺盤，利于傳熱。

3. 接種與混勻 | 在手套箱內(nèi)完成：① 火焰滅菌接種環(huán)/移液器頭；② 按 1 %–6 % 接種量接入種子液；③ 輕輕搖勻后立即轉入恒溫箱。 | 溫度設定：乳酸菌 37 ℃；丁酸菌 35 ℃；丙酮丁醇梭菌 34–37 ℃ | 避免劇烈晃動導致溶氧回升。

4. 過程監(jiān)控 | ① 每 12 h 記錄Eh、pH、產(chǎn)氣量；② 若Eh > –150 mV，補充氮氣 30 s；③ 固態(tài)發(fā)酵需稱重法測失水，及時補水。 | Eh –200 mV 至 –250 mV | 若出現(xiàn)指示條返藍，立即檢查密封條與鈀催化劑活性。

| 5. 取樣與收獲 | ① 通過傳遞箱同法取出樣品；② 快速封口，冰浴終止代謝；③ 進行菌落計數(shù)、代謝產(chǎn)物（乳酸、丁酸、硫苷降解率）測定。 | 取樣時間窗口 ≤ 60 s | 取樣后立即用氮氣吹掃傳遞箱，避免氧殘留。

三、常見問題與解決方案

1. 指示條持續(xù)變藍 | ① 鈀催化劑失活；② 密封條老化；③ 頻繁開門 | ① 160 ℃ 干烤 2 h 再生鈀催化劑；② 更換密封條；③ 合并操作，減少開門次數(shù)。

2. 菌體生長遲緩 | ① 接種量低；② 培養(yǎng)基預還原不足；③ 箱內(nèi)溫度波動 | ① 提高接種量至 5 % 以上；② 培養(yǎng)基使用前通氮 15 min 或加 0.05 % 半胱氨酸鹽酸鹽；③ 校準溫控探頭。

3. 固態(tài)基質(zhì)結塊、酸敗 | ① 含水率過高；② 供氧未排除 | ① 控制含水率 45 %–50 %；② 裝袋后再次抽真空-充氮封口。

4. 發(fā)酵罐與培養(yǎng)箱接口染菌 | 傳遞操作超時 | 設置30 s 倒計時提醒；采用快速接頭+酒精火焰雙保險。

四、工業(yè)放大提示  

1. 50 L 以上規(guī)模：可改用帶機械攪拌的厭氧發(fā)酵罐，取消通氣改為頂部氮氣層流保護，罐體耐壓 0.2 MPa。  

2. 連續(xù)補料：通過無菌蠕動泵連接培養(yǎng)箱側口，用正壓氮氣維持補料管路無氧。  

3. 在線監(jiān)控：安裝 DO（溶解氧）與 Eh 電極，聯(lián)動 PLC 自動補氮，Eh 設定點 –180 mV。

五、安全與維護  

1. 每次實驗完畢，用 75 % 酒精擦拭箱體內(nèi)壁并紫外照射 30 min。  

2. 每月檢查真空泵油位、更換干燥劑；每季度校準溫度與壓力傳感器。  

3. 謹防氫氣或甲烷積聚——定期用便攜式可燃氣體檢測儀巡檢。

通過以上步驟與對策，可確保厭氧培養(yǎng)箱在食品與發(fā)酵工業(yè)實驗中穩(wěn)定、安全、高效地運行，獲得可重復的實驗結果。

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