Mouse Liver Ductal Organoid Kit Plus (Differentiation)

小鼠肝膽管類器官培養(yǎng)基套裝Plus（分化）

1、 產(chǎn)品描述

?；镄∈蟾文懝茴惼鞴倥囵B(yǎng)基套裝Plus（分化）【Mouse Liver Ductal Organoid Kit Plus (Differentiation)】是一種化學定義的細胞培養(yǎng)基，用于建立和培養(yǎng)從成體干細胞衍生的小鼠肝膽管類器官。肝膽管的自我更新上皮細胞是由位于肝臟的干細胞及其祖細胞的擴增所驅(qū)動的。肝膽管類器官因其上皮在結(jié)構(gòu)、細胞類型組成和自我更新動力學方面的表現(xiàn)，而具有真實器官的特征。肝膽管類器官可以在分化培養(yǎng)基中誘導出肝樣細胞，為小鼠類肝臟發(fā)育和疾病的研究提供了的模型。

2、 產(chǎn)品信息

3、 其他自備材料和試劑

4、 小鼠肝膽管類器官培養(yǎng)基（分化）的使用說明

1、   收到類器官培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)基置于4℃冰箱進行解凍。

2、   待培養(yǎng)基解凍后上下顛倒充分混勻，在生物安全柜或潔凈工作臺中根據(jù)日常需求量進行分裝，推薦類器官培養(yǎng)基分裝成10mL/管，培養(yǎng)因子B分裝為40μL/管；

3、   分裝后的培養(yǎng)基請密封后儲存于-20℃，使用時取出分裝的培養(yǎng)基放置室溫平衡后即可使用。

5、 小鼠肝膽管類器官分化培養(yǎng)

注意：小鼠肝膽管類器官分化培養(yǎng)前需要經(jīng)過傳代擴增培養(yǎng)3天后進行

a)     原代小鼠肝膽管類器官的建立

1、   實驗前先將基質(zhì)膠放置4℃冰上解凍，同時取出培養(yǎng)基放置室溫平衡。與細胞接觸的離心管、試管或者塑料吸頭需要用類器官培養(yǎng)防粘附潤洗液潤洗后使用。

2、   取樣：小鼠斷頸處死，表面噴灑酒精殺菌。在無菌條件下取出小鼠肝臟組織，放入4℃預冷的上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基或含雙抗的DPBS中，清洗組織2次。

3、   使用鑷子將組織轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，在冰上用無菌的將碎為0.5~2mm2大小（能夠通過10mL移液管的）。

注：以下操作與細胞接觸的耗材均需用潤洗液潤洗后使用：

4、   用預冷的上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸樣本轉(zhuǎn)移15mL離心管中，補充預冷的上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基至10mL。

5、   用10mL移液器上下吹打至少10次，清洗組織。靜止1分鐘，待組織自然沉降至離心管底部，小心吸棄上清，重復清洗組織3次。

6、   將清洗后的組織用50倍組織體積的重懸，吹打重懸組織塊。于37℃，100rpm條件下的恒溫搖床中，水平振蕩消化30分鐘，每隔10分鐘觀察組織消化情況，待組織塊明顯分散，懸液較渾濁時，取適量組織消化懸液鏡檢，待懸液中有較多膽管結(jié)構(gòu)即可終止消化，若組織碎塊較大或消化不可適當延長消化時間。消化期間可以使用不同規(guī)格（順序從大到小如10mL、5mL、1mL）的移液管吹打組織消化懸液，幫助充分消化。當大多數(shù)組織片段能夠通過1mL移液器吸頭時，消化過程即完成。

7、   將FBS加入組織消化混合物中，最終濃度為2%，使用移液器反復吹打20次，靜止2分鐘后，收集上清，4℃下以250g離心3分鐘。

8、   在可見的紅色沉淀的情況下，吸棄上清液，加入2mL紅細胞裂解液重懸沉淀，在室溫下裂解紅細胞1分鐘，并在4℃下以250g離心3分鐘。

9、   吸棄上清液并將沉淀重懸于上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在4℃下以250g離心3分鐘，再次重復此步驟以去除消化液和FBS，在離心前可取適量的懸液進行細胞活性檢測。

10、 吸棄上清液，根據(jù)培養(yǎng)需求取適量細胞沉淀加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻。注：基質(zhì)膠應保存在冰上以防止其凝固。盡快進行該過程。大約10,000個細胞應接種在25μL基質(zhì)膠中或50個管狀結(jié)構(gòu)接種在25μL基質(zhì)膠中。不要過度稀釋基質(zhì)膠（基質(zhì)膠比例應>70%（基質(zhì)膠體積/總體積）），因為這可能會抑制固體液滴的正確形成。

11、 將基質(zhì)膠和細胞的混合懸液點入培養(yǎng)孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。

注意：一旦類器官重懸于基質(zhì)膠中，盡快進行種板，因為基質(zhì)膠可能會在試管或移液器吸頭中凝固。

12、 將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO₂的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。

13、 待基質(zhì)膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的小鼠肝膽管類器官擴增培養(yǎng)基（MA-0817H009HSP），避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。

注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因為這可能會破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

14、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO₂的恒溫培養(yǎng)箱中。

15、 每隔2~3天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡的小鼠肝膽管類器官擴增培養(yǎng)基（MA-0817H009HSP）。

16、 密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，理想情況下，小鼠肝膽管類器官應在7-14天內(nèi)建成。

b)      鼠肝膽管類器官的分化培養(yǎng)

1、   待類器官培養(yǎng)到直徑為500μm大小時（或變黑不再增大時），即可進行類器官的傳代（每代約1~2周）。以下操作與細胞接觸的耗材均需用潤洗液潤洗后使用。

2、   吸棄舊培養(yǎng)基，加入等體積上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用細胞刮刀或者移液管吸頭輕輕刮下（或吹打）基質(zhì)膠和類器官混合物，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中（每管最多收集2~3孔類器官，避免體積體積過大消化效率低），吹打5~10次，使類器官和基質(zhì)膠分離，300g離心3分鐘。

3、   去除上清液加入5倍于基質(zhì)膠和類器官混合物體積的類器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中消化5~10分鐘。取出吹打混勻，取10μL混合液鏡檢是否消化成小的細胞團塊，消化不充分可適當延長消化時間。密切監(jiān)視消化過程使在類器官解離液中的孵育時間最短。

4、   消化完成后，加入5倍體積上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹打混勻以終止消化反應，然后250g離心3分鐘。

5、   吸棄上清液，用上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2次以去除殘留的消化液。次清洗可將類器官合并收集在同一個離心管中。

6、   清洗完成后將離心沉淀中的細胞進行傳代培養(yǎng)，在細胞沉淀中加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻（注意，混勻吹打的動作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。注意：基質(zhì)膠稀釋比例應在70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7、   將基質(zhì)膠和細胞的混合懸液點入培養(yǎng)孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

8、   將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO₂的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。

9、   待基質(zhì)膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的小鼠肝膽管類器官擴增培養(yǎng)基（MA-0817H009HSP），避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。

注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因為這可能會破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

10、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO₂的恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)3天后，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡小鼠肝膽管類器官分化培養(yǎng)基（不添加培養(yǎng)因子B），每天更換一次培養(yǎng)基。

11、 使用小鼠肝膽管類器官分化培養(yǎng)基培養(yǎng)9天后，按照培養(yǎng)因子B標簽上的稀釋倍數(shù)配制含培養(yǎng)因子B的小鼠肝膽管分化培養(yǎng)基（例如：取10mL小鼠肝膽管分化培養(yǎng)基添加40μL培養(yǎng)因子B（250X），使用該培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)小鼠肝膽管類器官3天，期間需要每天更換一次含培養(yǎng)因子B的小鼠肝膽管分化培養(yǎng)基。）

V2.0版

更新時間：2025/6/17