KO first小鼠模型构建方法及应用

1. 构建方法

KO first（Conditional Ready）小鼠模型是一种多用途的基因敲除模型，通过在目的基因的特定位置插入特定的重组位点（如LoxP和FRT），实现全基因敲除或条件性基因敲除。以下是构建KO first小鼠模型的主要步骤：

设计靶向载体：在目的基因的外显子两侧插入方向相同的LoxP位点，并在靶片段5’端内含子中插入一个带有FRT位点的SA-IRES-reporter片段。这个片段包含一个报告基因（如GFP）和一个抗性基因（如Neo）。

构建Flox小鼠：通过同源重组技术，将靶向载体导入胚胎干细胞（ES细胞）中，然后将这些细胞注射到囊胚中，形成嵌合体小鼠。通过交配，获得携带LoxP位点的Flox小鼠。

全基因敲除：将Flox小鼠与全身表达Cre的小鼠交配，Cre重组酶会识别LoxP位点并切除目标基因，同时保留报告基因和抗性基因，得到全基因敲除的小鼠。

条件性基因敲除：将Flox小鼠与Flp工具鼠交配，Flp重组酶会识别FRT位点并切除SA-IRES-reporter片段，得到常规的Flox小鼠。然后将Flox小鼠与组织特异性的Cre工具鼠交配，实现条件性基因敲除。

2. 基因型鉴定

PCR鉴定：通过设计特异性引物，对小鼠基因组DNA进行PCR扩增，检测LoxP位点、FRT位点、报告基因和抗性基因的存在。

Southern blotting：通过限制性酶切和探针杂交，检测基因整合情况和敲除情况。

3. 应用

KO first小鼠模型具有广泛的应用，主要包括以下几个方面：

研究基因功能：通过全基因敲除或条件性基因敲除，研究基因在特定组织或发育阶段的功能。

疾病模型构建：模拟人类疾病的发生发展，研究疾病机制。例如，通过敲除肿瘤抑制基因构建肿瘤模型。

药物筛选和验证：评估药物的疗效和安全性，验证药物靶点的有效性。

基因表达示踪：通过报告基因的表达，示踪目标基因的表达情况，方便基因研究。

4. 优势与局限性

优势：

多用途：既可以实现全基因敲除，也可以实现条件性基因敲除。

灵活性：通过选择不同的Cre和Flp工具鼠，可以灵活地控制基因敲除的时间和空间。

局限性：

设计复杂：需要对基因进行全面分析，避免基因敲除导致内源性基因表达下调或截短蛋白的表达。

周期较长：构建过程涉及多个步骤，包括ES细胞打靶、嵌合体小鼠的获得和交配等，整个过程可能需要9-12个月。