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　　【化工儀器網(wǎng) 項(xiàng)目成果】12月14日，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所生物大分子國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室孫飛課題組與南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子微生物學(xué)與微生物工程實(shí)驗(yàn)室喬明強(qiáng)課題組合作，在Nature Communications上發(fā)表了題為A cryo-electron microscopy support film formed by 2D crystals of hydrophobin HFBI的研究成果。針對(duì)當(dāng)前冷凍電鏡樣品制備過(guò)程中普遍存在的由于氣液界面導(dǎo)致的樣品變性、解聚和取向優(yōu)勢(shì)問(wèn)題，該研究報(bào)道了一種用基于真菌疏水蛋白HFBI薄膜的新型冷凍電鏡支持膜技術(shù)，為相關(guān)問(wèn)題提出了有效的解決方案。
 

　　近年來(lái)，由于硬件和圖像處理算法上的不斷突破，冷凍電鏡單顆粒技術(shù)已成為研究生物大分子復(fù)合體三維結(jié)構(gòu)的主要研究手段之一，并已達(dá)到原子分辨率的水平。冷凍電鏡技術(shù)流程中的關(guān)鍵步驟包括冷凍樣品的制備，將生物大分子樣品快速冷凍在玻璃態(tài)冰中，用于下一步的冷凍電鏡成像。然而，實(shí)際研究工作中存在顆粒不進(jìn)孔、分布不均勻、取向優(yōu)勢(shì)嚴(yán)重、蛋白質(zhì)變性等問(wèn)題，導(dǎo)致無(wú)法解析樣品的高分辨率三維結(jié)構(gòu)，成為利用冷凍電鏡解析生物大分子復(fù)合體高分辨率三維結(jié)構(gòu)的瓶頸。近年來(lái)的研究逐步明確了該問(wèn)題的微觀機(jī)理是源于傳統(tǒng)冷凍制樣過(guò)程中的氣液界面效應(yīng)，生物物理所生物大分子國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室章新政課題組近期對(duì)于該機(jī)理問(wèn)題開(kāi)展了研究(Journal of Structural Biology 213, 107783)。孫飛課題組與生物物理所生物成像中心合作，圍繞冷凍電鏡樣品制備技術(shù)，開(kāi)發(fā)了微孔陣列碳支持膜GiG和微孔陣列非晶鎳鈦合金支持膜ANTA(Progress in biophysics and molecular biology 160, 5-15)，相關(guān)技術(shù)產(chǎn)品用于冷凍電鏡實(shí)際研究工作。在上述工作的基礎(chǔ)上，孫飛課題組基于喬明強(qiáng)課題組制備的真菌疏水蛋白HFBI研發(fā)了全新的冷凍電鏡支持膜HFBI-film，可有效解決由于氣液界面效應(yīng)導(dǎo)致的樣品變性、解聚和取向優(yōu)勢(shì)問(wèn)題，提高利用冷凍電鏡技術(shù)解析生物大分子復(fù)合物高分辨率三維結(jié)構(gòu)的通量與效率。
 

　　真菌疏水蛋白是一類由高等絲狀真菌分泌的小分子量蛋白質(zhì)(7-15kDa)，可在菌絲和孢子表面自組裝形成兩親性蛋白膜，在真菌不同發(fā)育階段中起到關(guān)鍵作用。疏水蛋白作為兩親性蛋白質(zhì)，其表面展現(xiàn)出明顯的疏水和親水性區(qū)域，使疏水蛋白成為表面活性最強(qiáng)的蛋白質(zhì)之一。良好的生物相容性、獨(dú)特的自組裝特性及高度的成膜穩(wěn)定性使疏水蛋白被廣泛用于食品乳化、藥物遞送、生物材料修飾和生物傳感器等領(lǐng)域。疏水蛋白HFBI是一類由瑞氏木霉生產(chǎn)的II型疏水蛋白，可以在氣液界面處自組裝成單層、高度有序的二維晶體結(jié)構(gòu)(圖1)。
 

　　本研究中，科研人員利用疏水蛋白HFBI自組裝形成的連續(xù)二維晶體薄膜來(lái)覆蓋微孔陣列非晶鎳鈦合金膜載網(wǎng)(圖2)，用于冷凍電鏡樣品制備。該載網(wǎng)天然親水，無(wú)須做輝光放電處理，通過(guò)靜電相互作用吸附蛋白顆粒來(lái)克服樣品與氣液界面接觸的問(wèn)題。該支持膜能夠幫助形成更均勻更薄的玻璃態(tài)冰，背景襯度低，有利于高分辨率和高信噪比的冷凍電鏡成像。研究人員用該載網(wǎng)解析了6種蛋白質(zhì)的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)(圖3)，包括兩個(gè)在冷凍電鏡實(shí)驗(yàn)中具有明顯取向優(yōu)勢(shì)的蛋白質(zhì)樣品——過(guò)氧化氫酶catalase和流感病毒血凝素HA，分子量最小可達(dá)64 kDa。結(jié)果表明，該新型冷凍電鏡支持膜載網(wǎng)可以有效解決氣液界面效應(yīng)，對(duì)不同分子量的樣品具有廣泛的適用性。此外，研究人員證明了該疏水蛋白膜是通過(guò)靜電相互作用來(lái)吸附蛋白顆粒，這一相互作用可以改變樣品溶液的pH值來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而為后期使用該支持膜載網(wǎng)提供了明確的優(yōu)化方向和手段。
 

　　研究工作得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中國(guó)-瑞士科技合作項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金、中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(B類)和北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的支持。相關(guān)成果已申請(qǐng)中國(guó)發(fā)明專利。該工作的電鏡數(shù)據(jù)收集工作均在生物物理所生物成像中心完成。
 

圖1.真菌疏水蛋白生理功能及HFBI結(jié)構(gòu)示意圖
 

圖2.疏水蛋白支持膜載網(wǎng)的制備流程圖
 

圖3.利用疏水蛋白支持膜載網(wǎng)所解析的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)