NADPH-細(xì)胞se素C 還原酶（NCR）活性測(cè)定試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

細(xì)胞色素P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。NCR 作為P450 酶系的重要一員，催化氧化型 P450 還原再生。

測(cè)定原理：

NCR 催化NADPH 還原氧化型細(xì)胞se素 C，還原型細(xì)胞se素C 在 550nm 處有特征吸收峰；通過測(cè)定550nm 吸光度的增加速率，來計(jì)算 NCR 活性。

NADPH-細(xì)胞se素C還原酶活性測(cè)定試劑盒

組成：

試劑一：粉劑×2 瓶，4℃保存。臨用前根據(jù)用量每瓶加 100mL 蒸餾水充分溶解。

試劑三：粉劑×1 管，-20℃保存。臨用前配制，加 1.04ml 蒸餾水充分溶解，4℃保存。試劑四：粉劑×1 管，4℃保存。臨用前配制，加 1100 μl 蒸餾水充分溶解，4℃保存。

注意事項(xiàng)：試劑三、試劑四臨用前配制，配好未使用完的 4℃可保存兩天。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板和蒸餾水。

粗酶液提取：

1、除去細(xì)胞核和線粒體等：稱約 0.5g 組織，加入 4℃預(yù)冷的 1ml 試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心 30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。

2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心 60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1ml 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g 離心 30min，棄

上清液。

4、最終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5ml，蓋緊后充分震蕩溶解，4℃保存待測(cè)。

NADPH-細(xì)胞se素 C 還原酶測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 550 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在 37℃水浴中預(yù)熱 30min。

3. 空白管：取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 10 μl 蒸餾水、180 μl 試劑二、10 μl 試劑三和 10 μl 試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測(cè)定 2min 內(nèi)吸光值變化，第 10s 和第 130s 吸光值。△A 空白管=A2-A1。

4. 測(cè)定管：取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 10 μl 提取液、180 μl 試劑二、10 μl 試劑三和 10 μl 試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測(cè)定 2min 內(nèi)吸光值變化，第 10s 和第 130s 吸光值?！?/span>A 測(cè)定管=A4-A3。

注意：空白管只需做一次。

NCR 活性計(jì)算公式：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細(xì)胞se素 C 為 1 個(gè)酶活單位。

NCR ((nmol/min /mg prot)= (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T

= 550×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷Cpr

（2） 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細(xì)胞se素C 為 1 個(gè)酶活單位。

NCR ((nmol/min/g 鮮重)= (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T

=275×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷W

ε：還原型細(xì)胞se素 C 摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光徑（cm），1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），210 μl=2.1×10^-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），10 μl=0.01mL；V 樣總：提取液體積，0.5ml；T：反應(yīng)時(shí)間（min）， 2min 。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細(xì)胞se素 C 為 1 個(gè)酶活單位。

NCR ((nmol/min/mg prot)= (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T

= 1100×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷Cpr

（2） 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細(xì)胞se素c 為 1 個(gè)酶活單位。

NCR ((nmol/min/g 鮮重) = (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T

= 550×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷W

ε：還原型細(xì)胞se素C 摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：96 孔板光徑（cm），0.5cm； V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），210 μl=2.1×10^-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定； V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），10 μl=0.01mL；V 樣總：提取液體積，0.5mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min）， 2min 。

NADPH-細(xì)胞se素C還原酶活性測(cè)定試劑盒