α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）活性测定试剂盒说明书

分光光度法 50 管/48 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰fu酶 A。

测定原理：

α-KGDH 催化α-酮戊二酸、NAD⁺ 和fu酶A 生成琥珀酰fu酶 A、二氧化碳和 NADH，NADH 在 340 nm有特征吸收峰，以NADH 的生成速率表示α-KGDH 活性。

 α-酮戊二酸脱氢酶活性测定试剂盒 糖酵解

组成：

试剂十：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 2.1ml 蒸馏水充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六、试剂七、试剂八和试剂九转移到试剂四中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1ml 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1ml 试剂一和 10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。

3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的α-KGDH（此步可选做）。

5、 在步骤④的沉淀中加入 200μl 试剂二和 2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体α-KGDH 活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm 处，蒸馏水调零。

2、工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min。

3、在 1ml 石英比色皿中依次加入 40μl 试剂十、60μl 样本和 1.1ml 工作液，混匀，立即记录 340nm 处 20s的吸光值A1 和 2min20s 时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

α-KGDH 活性计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

α-KGDH 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织在反应体系中每分钟生成 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

α-KGDH（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=325×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

α-KGDH 活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.65×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1.2×10^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.06 ml；

V 样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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