細(xì)胞周期檢測實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)共分以下4個主要步驟:

1.細(xì)胞鋪盤

HeLa S3細(xì)胞，密度為80%左右分盤 ，使鋪盤密度在50%左右，為滿足流式細(xì)胞儀上機(jī)要求，細(xì)胞數(shù)目需大于1x10°/組。

2.細(xì)胞同步化處理 :

a) 加入終濃度2mM的Thymidine同步化18h

b) 用溫育的PBS洗4次，更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)9h

c) 再加入2mM Thymidine再次同步化18h后

3.樣品收集;

a) 分別收取釋放2h(S期)，6h(G2/M期)和12h(G1期)細(xì)胞樣品

b) 每個樣品收取都使用預(yù)冷的PBS洗滌4次，1000g離心5min，棄上清

C)100ULPBS審懸沉促，吸取出細(xì)胞懸液干移液器中，干移去細(xì)胞的管中加入900uL預(yù)冷的70%一醇，漩渦振蕩器需蕩中滴入細(xì)胞懸液。

d)4℃固定一小時(shí)或更長時(shí)間。

e)1500rmp，離心10min，去固定液。

f)細(xì)胞染色液配制:50xRNaseA母液:50xPI母液:PBS=20:20:960;RNaseA母液濃度1mg/mL，工作濃度20ug/mL;PI母液濃度2.5mg/mL，工作濃度50ug/mL。

g)細(xì)胞37度染色1h。根據(jù)細(xì)胞量，加入一定體積的細(xì)胞染色液(1~1.5mL)重懸，使上機(jī)時(shí)細(xì)胞通過率為200~350Cell/s,染色液不可過多或過少，過多則細(xì)胞密度過低上機(jī)速度嚴(yán)重不足，過少則導(dǎo)致細(xì)胞粘結(jié)。

h) 300目篩網(wǎng)過濾至流式管中。

4.上機(jī)檢測;

流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，計(jì)數(shù)50000個細(xì)胞。

5.同步化數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用ModFit軟件分析。