當前位置:伊萊博生物科技(上海)有限公司>>實驗服務>>細胞實驗檢測服務>> 骨髓間充質干細胞原代培養(yǎng)實驗
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?試劑與耗材?
基礎培養(yǎng)基:α-MEM或DMEM-LG(含10%胎牛血清、1%雙抗)
分離液:Percoll密度梯度液(1.073 g/ml)或直接使用全骨髓貼壁法
器械:眼科剪、鑷子、1ml注射器(4.5號針頭)、200目細胞篩
?動物處理?
選擇4-6周齡BALB/c小鼠或SD大鼠,脫臼處死后75%酒精浸泡5分鐘
?骨髓沖洗?
剝離股骨/脛骨,剔除肌肉組織,用注射器(含培養(yǎng)基)沖洗骨髓至離心管
關鍵點:需強力沖洗3-5次以提高細胞得率(單鼠可得約7×10?個細胞)
?細胞分離(二選一)?
?密度梯度法?:骨髓懸液疊加Percoll液,2500rpm離心25分鐘,吸取白膜層
?全骨髓法?:直接過濾后接種,48小時后換液去除未貼壁細胞
?接種參數(shù)?
密度:1×10? cells/ml(T25培養(yǎng)瓶)或2.5×10? cells/ml(培養(yǎng)皿)
條件:37℃、5% CO?,第一次換液時間為接種后3小時(去除紅細胞)
?后續(xù)處理?
每2-3天換液,7-10天可見梭形貼壁細胞(純度約60-70%)
傳代:80%融合時用0.25%Pancreatin?消化,傳代比例1:2
?污染控制?:超凈臺紫外滅菌30分鐘,操作中頻繁火焰消毒器械
?形態(tài)鑒別?:原代BMSCs呈紡錘形,混雜造血干細胞呈圓形(需通過換液逐步去除)
?血清選擇?:建議使用批次驗證的胎牛血清(濃度可提升至15%促進初期貼壁)
?分化研究?:成骨/成脂誘導培養(yǎng)需從P1代開始
?臨床潛力?:用于軟骨修復或神經(jīng)再生治療
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