炭疽杆菌PCR检测试剂盒用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。检测原理如下：鲎试剂为鲎科动物东方鲎（TAL）的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品, 鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在适宜的条件下(温度，pH 值及无干扰物质），细菌内毒素激活 C 因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax=405nm）。在一定时间内，pNA 的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量样品的内毒素浓度。同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了样品本身的颜色对 405nm 处吸收峰的干扰。特异性鲎试剂是在鲎试剂的配方中添加 G 因子旁路抑制剂，使鲎试剂对（1,3）β-D-葡聚糖产生假阳性反应，使检测结果更加准确可靠。本鲎试剂对细菌内毒素的反应是特异的，抗干扰能力比普通鲎试剂更强，使用时只需
用细菌内毒素检查用水直接溶解即可，不需另外添加 G 因子抑制剂（抗增液）。
炭疽杆菌PCR检测试剂盒具有下列特点：
1. 仅用于体外细菌内毒素的定量检测，严禁试剂以任何途径进入机体。
2. 接触试剂及样品的所有器皿必须是除热原的。实验过程应防止微生物的污染。该说明书中的除热原指内毒素浓度小于 0.005 EU/ml。玻璃器皿可经 250℃干烤至少 60 分钟去除热原。
3. 待测样品的 pH 值应在 6.0–8.0 之间，若超出此范围，需用除热原的缓冲液、0.1M 氢氧化钠或 0.1M 盐酸调节。
4. 当样品中可能存在鲎实验的干扰物质时，须进行干扰实验。
规格及成分 成份 32 次包装
细菌内毒素标准品 2 支
特异性鲎试剂 2 支×1.7 mL
显色基质 2 支×1.7 mL
偶氮化试剂 1 2 支×10 mL
偶氮化试剂 2 2 支×10 mL
偶氮化试剂 3 2 支×10 mL
HCl (反应终止剂) 50 mL
细菌内毒素检查用水 50 mL×2 瓶
使用手册 1 份
除热原试管，10×75mm 10×5 支
除热原吸头，1000VL 10×4 支
除热原吸头，200VL 1 盒

运输及保存 常温运输，4℃避光保存，有效期两年。
自备试剂仪器
旋涡混合仪、移液器、多道移液器、试管架、恒温水浴箱（37±1℃）、分
光光度计。
使用方法 1. 样品的贮存与预处理
1.1 若样品为一些抗菌素如头孢类抗菌素和磺胺制剂会对偶氮染色剂产生偶联反应而干扰偶氮化显色，需要选用不含偶氮化试剂的试剂盒。
1.2 若样品的本底吸光度值大于0.5,必须对样品进行稀释后再检测。
1.3 若样品颜色较深(例如溶血)，或在酸性条件下颜色加深(例如一些组织培养介质),必须设置样品空白管以扣除样品自身的颜色本底。样品空白管不加入特异性鲎试剂，以等体积鲎试剂的溶剂(该处为细菌内毒素检查用水)代替。其余操作同样品管。
2. 实验操作
2.1 细菌内毒素标准溶液配制
标准曲线所采用的内毒素浓度可以为0.01, 0.025, 0.05, 0.1EU/mL
或0.1, 0.25, 0.5,1.0EU/mL。稀释方法如下（以0.1, 0.25, 0.5, 1.0
EU/mL为例）：取细菌内毒素标准品1支，按细菌内毒素工作标准品使
用说明稀释为10EU/mL的内毒素溶液，再稀释为1.0EU/mL的内毒素
溶液，以 1.0EU/mL 的内毒素溶液为母液按下表稀释成
0.1,0.25,0.5,1.0 EU/mL的浓度梯度。配制好的内毒素标准溶液应在4
小时内用完。
表1 内毒素标准溶液配制
内毒素浓度(EU/mL)
1 0.5 0.25 0.1
加细菌内毒素检查用水(mL) 0 0.5 0.75 0.9
加 1EU/ml 内毒素溶液(mL) 1 0.5 0.25 0.1
2.2 阴性对照为细菌内毒素检查用水。
2.3 特异性鲎试剂、显色基质、偶氮化试剂等的溶解
特异性鲎试剂：按标示量加细菌内毒素检查用水于特异性鲎试剂中，轻轻振摇使特异性鲎试剂*溶解, 注意不要用旋涡混匀剧烈振摇。溶解的特异性鲎试剂应在10分钟内用完。显色基质：按标示量加细菌内毒素检查用水于显色基质中，轻轻振摇使显色基质*溶解。显色基质溶液可在无污染的条件下于4 ºC贮存8小时以内。
偶氮化试剂1：按标示量加反应终止剂盐酸于偶氮化试剂1中，
偶氮化试剂2：按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂2中，
偶氮化试剂3：按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂3中，
偶氮化试剂溶液可于4ºC贮存1周。
2.4 实验操作
 取无热原试管，加入100 uL细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或待测样品。再加入100 uL特异性鲎试剂溶液，混匀，37ºC温育T1分钟。温育结束，加入100 uL显色基质溶液，混匀，37ºC温育T2分钟。温育结束，加入500 uL偶氮化试剂1溶液，混匀，加入500uL偶氮化试剂2
溶液，混匀加入500 uL偶氮化试剂3溶液，混匀，静置5分钟，于545nm
波长处读取吸光度值。(见表２)
表 2 实验操作
 阴性对照 内毒素标准 样品
加细菌内毒素检查用水(uL) 100
加内毒素标准溶液(uL) 100
加待测样品(uL) 100
加特异性鲎试剂(uL) 100 100 100
混匀，37ºC 温育 T1分钟
加显色基质溶液(uL) 100 100 100
混匀，37ºC 温育 T2分钟
加偶氮化试剂 1 溶液(uL) 500 500 500
混匀，加偶氮化试剂2溶液(uL) 500 500 500
混匀，加偶氮化试剂3溶液(uL) 500 500 500
混匀,静置5分钟，于λ545nm测OD值
本试剂盒建议反应时间T1及T2如下：
内毒素标准范围（EU/mL）为0.01-0.1，T1为30分钟，T2为6分钟；
内毒素标准范围（EU/mL）为0.1-1，T1为10分钟，T2为6分钟。
3. 数据处理
建立标准曲线：Y = b X + a，其中 Y为545nm处吸光度值，X为内毒素
的浓度，b为直线斜率，a为Y轴截距。
当实验数据同时满足如下三个条件时实验才有效：
3.1 标准曲线的相关系数r≥0.980，
3.2 标准曲线zui低点的Y值大于阴性对照的Y值，
3.3 待测样品平行管的平均值在标准曲线的区间内。
待测样品的干扰实验
待测样品的干扰实验详见《中华人民共和国药典》2010细菌内毒素检查法》
的“光度测定法干扰实验”。当特异性鲎试剂、待测样品的来源、配方、
生产工艺改变或实验环境中发生了任何有可能影响实验结果的变化时，须
进行干扰实验,步骤如下:
1 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为待测样
品干扰实验中添加的内毒素浓度，配制含λm内毒素的待测样品阳性对照，
测量出该溶液的内毒素浓度,称为Cs；
2 测量出未添加外源内毒素的待测样品溶液内毒素浓度,称为Ct；
3 计算该实验条件下的回收率R＝（Cs–Ct）/λm×100%
4 当R在50%～200%之间，则认为在此实验条件下待测样品溶液不存在干扰
作用。
5 当R在50%～200%之外，需对待测样品进行系列稀释(稀释倍数不得超过zui大有效 稀释倍数MVD)或进行其它处理消除干扰,每一稀释溶液都重复步骤1-3,直到内毒素的回收率R在50%～200%之间。选择回收率Rzui接近100%的稀释倍数进行内毒素检测。
附件
细菌内毒素标准品使用说明
本品为白色疏松海绵状固体，系参照中国药品生物制品检定所的细菌内
毒素工作标准品标定的大肠杆菌内毒素冻干品，供鲎实验中的特异性鲎试
剂灵敏度复核、干扰实验和各种阳性对照。
用法：
1. 溶解：加入细菌内毒素检查用水（BET水）1 mL, 复溶后置涡旋混匀器
上混匀15 min。
2. 稀释：将上述内毒素溶液进一步用细菌内毒素检查用水稀释成各个不同浓
度2λ、λ、0.5λ、0.52λ等浓度。
注意事项：
1. 本品为一次性使用。仅供体外鲎实验检测，禁止用于注射、口服等。
2. 实验所用的器皿需经过处理，以除去可能存在的外源性内毒素，可以经
250℃干烤至少60分钟处理，也可以采用其他确保不干扰细菌内毒素检测的
适宜方法处理。实验操作过程中应该防止微生物的污染。
3. 稀释的内毒素溶液静置时间超过10分钟，用前需要在涡旋混匀器上剧烈混
匀1分钟，放置4小时以上的内毒素溶液应丢弃。