一管式点突变试剂盒基因的定点突变是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。但传统的方法需要使用单链 DNA 模板，而得到单链 DNA 模板又需要
先将基因克隆到类似 M13 这种载体中，操作过程冗长。为了克服这些缺点，本公司将突
变位点设计到一对互补的引物中，用高保真扩增质粒模板，然后用 Dpn I 去除原始的甲
基化模板，新合成的 DNA 通过互补形成带切口的双链质粒，直接用于转化感受态细菌。
本方法过程示意图如下：

一管式点突变试剂盒具有下列特点：
1. 直接使用质粒 DNA 作为模板，免去了制备单链 DNA 的步骤。
2. 基于高保真 PCR，对模板 DNA 序列没特殊要求，可以用于突变任何序列。
同时对模板的需求量很少。
3. 一管式，全部在一个优化的缓冲体系中完成，非常简单。
4. 使用 Dpn I 去除未突变模板，突变效率高达 90%。
5. 可用于制备点突变，缺失突变和插入突变。
6. 本产品 A 型适用于 8 kb 以下，B 型适用于 8-15 kb。
规格及成分 成 份 编 号 A 型 10 次包装 B 型 10 次包装
高保真酶 A 型 10 uL 无
高保真酶 B 型 无 10 uL
5×高保真酶 Buffer A 型 100 uL 无
5×高保真酶 Buffer B 型 无 100 uL
dNTP（2.5 mM each） 50 uL 50 uL
Dpn I 酶 10 uL 10 uL
超纯水 100935 1 mL 1 mL
使用手册 1 份
运输及保存 低温运输、-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂 质粒 DNA、突变引物、细菌转化试剂
使用方法 一、 引物设计及注意事项
用于特定基因突变的引物必须用户单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计。
1. 共需设计两条*互补的一对引物，它们覆盖要扩增的突变区位点，突变位点
zui放在引物的中心?？梢韵燃猩杓埔惶酰缓缶涂傻没ゲ沟牧硪惶跻?。
2. 引物的长度通常为 25-45 个碱基。引物中突变位点任何一侧都必需满足 Tm 大
于 45 的条件，Tm 计算方式为 Tm=4×(GC 碱基数)＋2×(AT 碱基数)。例如
引物 agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就达到此标准，它的突变位点
AAG 所放位置使左侧 Tm＝46；右侧 Tm＝48，均大于 45。
3. 尽量把引物的 GC 含量控制在 40％-60％，结尾的 1-3 个碱基zui是 G 或 C。
4. 尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。
5. zui使用经过 PAGE 纯化的引物或更高纯度的引物。
二、待突变模板质粒的选择
1. 必需使用从 dam＋的大肠杆菌(这类菌中质?？梢员患谆?中抽提得到的质粒
用于基因定点突变，否则 Dpn I 不能把没有酶切的质粒 DNA 切除，产生大量
的假阳性。常用的大部分大肠杆菌都是 dam＋的，包括 DH5α、JM109 等。
不能使用 JM110 和 SCS110 以及其它 dcm-菌种。
2. 待突变质粒和目的基因的 GC 含量应该在 40-55％，没有任何 GC 含量超过
70%、长度在 50bp 以上的区域。如果质粒 GC 含量过高，请先把目的基因克
隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。如果目的基因 GC 含量过
高，而突变位点不在高 GC 含量区域，可以先把该基因的不含高 GC 含量的一
个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如
果突变位点在高 GC 区，则可以使用高 GC PCR 反应试剂。
三、 基因定点突变反应
1. 在一个塑料离心管中加入下列成分：
待突变模板质粒 0.1-0.5 ug
5×高保真酶 Buffer 10 uL
引物一 (10-20 uM) 1 uL
引物二 (10-20 uM) 1 uL
dNTP Mix (2.5 mM each) 4 uL
补水到 49 uL
2. 加入 1 uL 高保真 DNA 聚合酶，混匀，如果 PCR 仪没有热盖则需要加少量石
蜡油。放入 PCR 仪器中按下面参数进行 PCR：
步骤 温度 时间 循环数
变性 95℃ 1 分钟 1 次
PCR
（注：只 18 次循环）
95℃ 40 秒
60℃ 1 分钟 18 次
68℃ 1 分钟/Kb
延伸 72℃ 10 分钟 1 次
保存 4℃ 长时间保持
四、Dpn I 消化：
PCR 反应后，直接在 PCR 反应体系中加入 1uL Dpn I 内切酶 （该酶在甘油保
存液中会下沉到管底，故用前需要充分混匀）。DpnI 可以酶切双链都被甲基化的模
板质粒，也能降解一条链被甲基化的双链质粒?；煸群?37℃孵育 2 小时后样品可以
直接用于转化，或者-20℃保存备用。
五. 转化、挑克隆鉴定：
每 100 微升感受态细菌（转化效率必须在 107 /ug 以上）中可以加入 5-10
微升经过Dpn I消化后的突变产物，按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作。
如果 PCR 使用了石蜡油，在转化时千万别把它带入转化反应，否则会严重影响转
化效率。在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌全部涂布到含有适
当抗生素的平板上培养过夜。通常会得到 50 个以下的克隆，可按常规方法制备质
粒并测序。
六、常见问题：
1. 转化后没有克隆或克隆数极少：(1) 感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态
细胞的效率，确保转化效率在 107 /ug。(2) 把 Dpn I 消化后的产物用常规的乙醇
沉淀浓缩，这样就可以把所有的产物全部用于转化。(3) 优化基因定点突变中的PCR
参数。可以把zui初的 95℃变性时间延长为 2 分钟，循环中 95℃变性的时间延长至
1 分钟，把循环中的 68℃的延伸时间改为 1.5 分钟/kb 至 2 分钟/kb，退火可以
改为 60-55℃或 65-55℃等的 touch down，退火时间也可以适当延长。(4) 引物
设计有问题。通过突变反应中的 PCR 没有很好地扩增出预期的突变质粒。
2. 有克隆，但没有或很难检测到预期的突变克?。?1) 使用的待突变的模板质粒量
过多，导致 Dpn I 消化时不*，可减少质粒用量。
3. 有突变克隆，但突变位点不是预期的位点：(1) 引物设计不佳，退火温度过低，
导致引物退火到错误的地方。(2) 引物质量较差，没有经过 PAGE 纯化。这样引物
中通?；岷斜壬杓频囊镆痰奶匾煨越喜畹囊?，容易导致非预期的突变。