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Caspase 1活細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色）

產(chǎn)品描述
　　活細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒基于半胱天冬酶的熒光抑制劑。這些抑制劑具有細(xì)胞滲透性和非細(xì)胞毒性。一旦進(jìn)入細(xì)胞，半胱天冬酶抑制劑與活性半胱天冬酶共價(jià)結(jié)合。 Caspase-1主要參與促炎細(xì)胞因子的激活和細(xì)胞凋亡過程。已經(jīng)證明胱天蛋白酶1對(duì)肽序列Tyr-Val-Ala-Asp（YVAD）具有底物選擇性。該試劑盒使用FAM-YVAD-FMK作為半胱天冬酶1活性的熒光指示劑。 FAM-YVAD-FMK在凋亡細(xì)胞中不可逆地結(jié)合活化的半胱天冬酶1。一旦與半胱天冬酶1結(jié)合，熒光試劑保留在細(xì)胞內(nèi)。結(jié)合抑制胱天蛋白酶1但不會(huì)阻止細(xì)胞凋亡的進(jìn)行，有多種參數(shù)可用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡。
產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)
　　這種試劑盒旨在通過測(cè)量活細(xì)胞中的caspase 1活化來檢測(cè)細(xì)胞凋亡。它用于定量凋亡細(xì)胞中活化的半胱天冬酶1活性，或用于篩選半胱天冬酶1抑制劑。綠色標(biāo)記試劑FAM-YVAD-FMK允許通過熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀直接檢測(cè)凋亡細(xì)胞中活化的半胱天冬酶1。該試劑盒為所有必需組分提供優(yōu)化的分析方案。
技術(shù)資料
1.Ex(nm)：493
2.Em(nm)：517
訂購信息

產(chǎn)品組分

實(shí)驗(yàn)方案
1.用密度為5×105到2×106個(gè)細(xì)胞/ mL的測(cè)試化合物制備細(xì)胞。
2.將FAM-YVAD-FMK以1：150的比例加入到細(xì)胞溶液中。
3在室溫下孵育1小時(shí)。
4.將細(xì)胞沉淀，用緩沖液或生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌并重懸細(xì)胞。
5.在Ex / Em = 490 / 525nm處分析細(xì)胞。
【注】：使用前將所有部件在室溫下解凍。
操作步驟
1.根據(jù)您的特異性誘導(dǎo)方案，將細(xì)胞培養(yǎng)至適于細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的密度，但不超過2 x 106個(gè)細(xì)胞/ mL。同時(shí)，對(duì)于每種標(biāo)記條件，以與誘導(dǎo)群體相同的密度培養(yǎng)非誘導(dǎo)的陰性對(duì)照細(xì)胞群。以下是一些誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞凋亡的例子：
（1）用2μg/ ml喜tree堿處理Jurkat細(xì)胞3小時(shí)。
（2）用1μM星形孢菌素處理Jurkat細(xì)胞3小時(shí)。
（3）用4μg/ ml喜tree堿處理HL-60細(xì)胞4小時(shí)。
（4）用1μM星形孢菌素處理HL-60細(xì)胞4小時(shí)。
【注】：應(yīng)對(duì)每個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行單獨(dú)評(píng)估，以確定誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的合適細(xì)胞密度。
2.通過向FAM-YVAD-FMK（組分A）的小瓶中加入50μLDMSO制備150X FAM-YVAD-FMK DMSO儲(chǔ)備溶液。
3.將150×FAM-YVAD-FMK DMSO儲(chǔ)備溶液（來自步驟1）以1：150的比例添加到細(xì)胞溶液中，并將細(xì)胞在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。
【注1】：對(duì)于FAM-YVAD-FMK標(biāo)記，細(xì)胞可以濃縮至~5×10 6個(gè)細(xì)胞/ mL。未使用的150X FAM-YVAD-FMK DMSO儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在 -20 ℃。
【注2】：對(duì)于粘附細(xì)胞，用0.5mM EDTA輕輕提起細(xì)胞以保持細(xì)胞完整，并在用FAM-YVAD-FMK孵育之前用含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。
【注3】：適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間取決于所用的細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度。優(yōu)化每個(gè)實(shí)驗(yàn)的孵育時(shí)間。
4.將細(xì)胞以約200g旋轉(zhuǎn)5分鐘，并用1mL洗滌緩沖液（組分B）洗滌細(xì)胞兩次。將細(xì)胞重懸于所需量的洗滌緩沖液中。
【注1】：FAM-YVAD-FMK是熒光的，因此清除任何未結(jié)合的試劑以消除背景非常重要。
【注2】：對(duì)于分離的細(xì)胞，應(yīng)將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至每個(gè)微量滴定板孔中2-5×10 5個(gè)細(xì)胞/100μL等分試樣，用于步驟6。
5.如果需要，用DNA染色標(biāo)記細(xì)胞（如用于死細(xì)胞的碘化丙錠，或用于細(xì)胞核染色的整個(gè)群體的Hoechst）。
6.通過熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 490 / 525nm處檢測(cè)熒光強(qiáng)度（對(duì)于碘化丙錠，Ex / Em = 535/635 nm;對(duì)于Hoechst染料，Ex / Em = 350 / 461納米）。
（1）對(duì)于流式細(xì)胞儀，使用FL1通道監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度（FL2通道用于碘化丙錠染色）。
（2）用于熒光顯微鏡和熒光酶標(biāo)儀。將100μL細(xì)胞懸浮液置于96孔黑壁/微量滴定板透明底部的每個(gè)孔中。
【注】：如果需要平衡細(xì)胞濃度，調(diào)整誘導(dǎo)細(xì)胞的懸浮體積以接近非誘導(dǎo)細(xì)胞群的細(xì)胞密度。如果您的細(xì)胞治療不會(huì)導(dǎo)致受刺激細(xì)胞群數(shù)量的顯著損失，則此調(diào)整步驟是可選的。
（3）使用FITC通道在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞（用于碘化丙啶染色的TRITC通道，用于Hoechst染色的DAPI通道）。
（4）使用熒光酶標(biāo)儀，使用Ex / Em = 490 / 525nm（在515nm處截止）底部讀取模式監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。
注意事項(xiàng)
該產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。