研究背景：
液滴微流控，作為近年來發(fā)展起來的一種高通量檢測篩選技術(shù)，因其低成本，超高通量等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用用酶定向進(jìn)化、抗體開發(fā)、高產(chǎn)菌株篩選等領(lǐng)域。熒光激活的液滴分選是目前主流的微流控篩選方法，而多色熒光檢測，為更加靈活的選擇熒光標(biāo)簽，構(gòu)建更加復(fù)雜的多參數(shù)熒光體系，提供了重要支持。
本實驗通過將綠色和紅色熒光微球混合后進(jìn)行液滴包裹，然后對液滴進(jìn)行雙激光同時激發(fā)和檢測，獲得微球在液滴內(nèi)包裹狀態(tài)的數(shù)據(jù)，從而驗證DREM cell平臺對多色熒光檢測和篩選的功能適用性，為相關(guān)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
實驗過程：
1、樣品處理：將綠色熒光微球（λex=488nm；λem=520nm；粒徑5um）和紅色熒光微球（λex=620nm；λem=680nm；粒徑5um）濃度調(diào)整為5x10^6/ml；按照1：1的比例將兩者混勻；
2、使用液滴微流控細(xì)胞分選儀（DREM cell）將上述樣品包裹進(jìn)微液滴，分別采集520nm通道（PMT3）、670nm通道（PMT1）的熒光信號，對目標(biāo)液滴群體圈門后，進(jìn)行分選；DREM cell儀器的使用流程如下所示：
實驗結(jié)果：
1、分別采集520nm通道（PMT3）、670nm通道（PMT1）的信號，在兩個通道的實時信號圖中，能夠?qū)芯G色熒光微球，含有紅色微球，以及共包裹有紅色熒光微球和綠色熒光微球的液滴進(jìn)行識別和區(qū)分；
2、在二維散點圖中，分別對P1、P2、P3液滴群體進(jìn)行圈門，分選，對收集到的液滴進(jìn)行鏡檢觀察，如下圖：P1群體分選得到的為紅色熒光微球，P2群體分選得到的為綠色熒光微球，P3群體分選得到的為共包裹紅色熒光微球和綠色熒光微球的液滴，符合預(yù)期；
實驗結(jié)論：
本實驗利用天木生物開發(fā)的液滴微流控細(xì)胞分選儀（DREM cell），對混合含有紅色熒光微球的液滴、綠色熒光微球的液滴、以及共包裹兩種微球的液滴進(jìn)行了識別和區(qū)分，并根據(jù)雙熒光檢測通道的信號進(jìn)行了圈門，成功對混合液滴中的三類液滴群體進(jìn)行了篩選，表明了系統(tǒng)分選的準(zhǔn)確性。
應(yīng)用展望：
對于目標(biāo)樣品的多種不同熒光信號的同時檢測和分析在高通量篩選研究中具有重要作用，如多功能酶進(jìn)化研究、蛋白互作研究、免疫細(xì)胞篩選研究、多種熒光PCR研究，抗體篩選等，其中酶進(jìn)化研究的典型案例如下圖所示：
該研究通過使用兩種不同熒光標(biāo)記的底物，實現(xiàn)了對布洛芬酯酶的立體選擇性這一復(fù)雜性狀的改造，經(jīng)過五輪的突變和篩選，得到的優(yōu)質(zhì)突變體對S-布洛芬底物的選擇性提升了700倍（DOI: 10.1038/s41467-018-03492-6）
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