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免疫組化的實(shí)驗(yàn)方法及操作流程
點(diǎn)擊次數(shù)：1548 發(fā)布時(shí)間：2016-9-12
免疫組化的實(shí)驗(yàn)方法及操作流程
（1）脫蠟和水化
脫蠟前，應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。
1）組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；
2）無水乙醇中浸泡5分鐘；
3）95%乙醇中浸泡5分鐘；
4）70%乙醇中浸泡5分鐘；
（2）抗原修復(fù)
用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。
1）抗原熱修復(fù)
在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進(jìn)行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會(huì)升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù)。
2）煮沸熱修復(fù)
電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10~15分鐘。
3）微波熱修復(fù)
在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5~10分鐘，反復(fù)1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，ChromograninA，Cyclin，ER，Heatshockprotein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
4）酶消化方法
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱至37℃，切片也預(yù)熱至37℃，消化時(shí)間約為5~30分鐘；胃蛋白酶消化37℃時(shí)間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
（3）免疫組織化學(xué)染色
常見的染色方法有兩種：SP法，SABC法。以下分別列出兩種方法的實(shí)驗(yàn)步驟。
SP法
1）脫蠟、水化；
2）PBS洗2~3次各5分鐘；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘
4）PBS洗2~3次各5分鐘；
5）抗原修復(fù)；
6）PBS洗2~3次各5分鐘；
7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時(shí)或者4℃或者37℃1小時(shí)。
9）4℃后需在37℃復(fù)溫45分鐘。
10）PBS洗3次各5分鐘；
11）滴加Ⅱ抗40~50μl,室溫靜置，或37℃1小時(shí)；
12）抗中可加入0.05%的tween-20.
13）BS洗3次各5分鐘；
14）DAB顯色5~10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；
15）PBS或自來水沖洗10分鐘；
16）蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化；
17）自來水沖洗10~15分鐘；
18）脫水、透明、封片、鏡檢。
SABC法
1）脫蠟、水化。
2）PBS洗兩次各5分鐘。
3）用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5~10分鐘，蒸餾水洗3次。
4）抗原修復(fù)。
5）PBS洗5分鐘。
6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。
7）滴加Ⅰ抗，室溫1小時(shí)或者4℃或者37℃1小時(shí)（4℃后在37℃復(fù)溫45分鐘）。
8）PBS洗三次每次2分鐘。
9）滴加生物素化二抗，20℃~37℃20分鐘。
10）PBC洗3次每次2分鐘。
11）滴加試劑SABC，20℃~37℃20分鐘。
12）PBS洗4次每次5分鐘。
13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。
14）蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。
15）脫水、透明、封片、鏡檢。