腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0430
规格：25T/12S、50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

25T溶液的配制：

1. 试剂二：临用前将试剂二A加入5mL试剂二B充分溶解，用不完的试剂建议-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

2. 试剂三：临用前取1支加1.5 mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂建议-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

3. 试剂四：临用前加入500 μL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂-20℃分装保存四周，避免反复冻。

4. 试剂五：临用前加入500 μL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂-20℃分装保存四周，避免反复冻。

50T溶液的配制：

1. 试剂二：临用前取1瓶试剂二A加入5mL试剂二B充分溶解，用不完的试剂建议-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

2. 试剂三：临用前取1瓶加3 mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂建议-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

3. 试剂四：临用前取1支加入500 μL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

4. 试剂五：临用前取1支加入500μL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

产品说明：
AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。
AGP催化的逆向反应生成G-1-P，在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下测定NADPH增加速率，即可计算AGP活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
称取约0.1g组织加入1mL提取液，冰浴中匀浆。10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤

1. 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 在EP管中按顺序加入下列试剂

迅速混匀后在340nm波长下测定10s吸光值A1和130s吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。
三、AGP活性计算

1. 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活性单位。
AGP活性（U/mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷T÷（Cpr×V样本）=380.5×ΔA÷Cpr
（此法需要自行测定粗酶液蛋白质浓度）

1. 按照样本质量计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
AGP活性（U/g 质量）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷T÷（W×V样本÷V提?。?span style="font-family: Times New Roman, Times, serif">=380.5×ΔA÷W
T：反应时间，15min；ε：NADPH消光系数，6.22×10^-3mL/nmol/cm；V反总：反应总体积，0.71mL；d：石英比色皿光程，1cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V样本：加入的样本体积，0.02mL；V提?。杭尤氲奶崛∫禾寤?，1mL；W：样本质量，g。
注意事项：
如果一次性测定样本较多，可将试剂一、二按比例配成混合液1，将试剂一、三、四和五按比例配成混合液2。
若测定数值较小，可以加大样本量或者延长第二步反应时间。
实验实例：

1. 取0.1g柳树叶片加入1mL提取液冰浴中匀浆。10000g ，4℃离心10min，取上清置冰上，之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA=A2-A1=0.55-0.491=0.059，按样本质量计算酶活得：AGP活性（U/g 质量）=380.5×ΔA÷W=224.495 U/g 质量。

参考文献：

1. Baroja-Fernández E, Zandueta-Criado A, Rodr??guez-López M, et al. Distinct isoforms of ADPglucose pyrophosphatase and ADPglucose pyrophosphorylase occur in the suspension-cultured cells of sycamore (Acer pseudoplatanus L)[J]. FEBS letters, 2000, 480(2-3): 277-282.

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