Firefly & Renilla Assay Kit（雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒）為檢測基因的表達(dá)量提供有效的手段，在 DLR檢測中，螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）和海腎螢光素酶（Renilla luciferase）的活性可在單個樣品中依次檢測。先以螢光素（Luciferin）為底物來檢測螢火蟲螢光素酶的活性，然后加入抑制螢火蟲螢光素酶催化的物質(zhì)，同時加入腔腸素（Coelenterazine）檢測海腎螢光素酶的活性，實現(xiàn)雙螢光素酶報告基因檢測。通過螢光素酶和其底物這一生物發(fā)光體系，可以非常靈敏、高效地檢測基因的表達(dá)。通常把感興趣基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或 5' 啟動子區(qū)克隆在 Luciferase 的上游，或把 3'-UTR 區(qū)克隆在 Luciferase 的下游，構(gòu)建成報告基因（Reporter gene）質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用適當(dāng)藥物等處理細(xì)胞后裂解細(xì)胞，通過檢測螢光素酶活性的高低來判斷藥物處理等對目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。海腎螢光素酶更多地被用作檢測轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參，以消除細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的差異。
        螢火蟲螢光素酶是一種分子量約為 61 kD 的蛋白，在 ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化螢光素生成氧化螢光素（Oxyluciferin），在螢光素被氧化的過程中，會產(chǎn)生光信號。海腎螢光素酶是一種分子量約為 36 kD 的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化腔腸素氧化成腸酰胺（Coelenteramide），在腔腸素氧化的過程中也會產(chǎn)生光信號。本試劑盒的光信號可以通過化學(xué)發(fā)光儀、酶標(biāo)儀或液閃測定儀進(jìn)行測定。該試劑盒具有檢測迅速、靈敏度高、檢測范圍廣，無細(xì)胞內(nèi)源活性干擾等特點。
產(chǎn)品特點：
快速：細(xì)胞裂解在10-15 min內(nèi)完成。
方便：試劑易于配制，樣品檢測步驟簡單。
靈敏：能夠檢測10-20mol的螢光素酶。
酶的濃度線性范圍可達(dá)8個數(shù)量級。
產(chǎn)品組分：

1、細(xì)胞裂解
（1）將培養(yǎng)基移除，加 PBS 輕輕洗滌兩次（貼壁細(xì)胞可直接進(jìn)行此操作，懸浮細(xì)胞需離心收集細(xì)胞）。按如下方案加入 1×Lysis Buffer（用無菌水按 4: 1 稀釋組分 A），然后將培養(yǎng)板放在微型震蕩器上室溫震蕩 15 min，充分裂解細(xì)胞。
注：裂解產(chǎn)物可室溫保存 6 h，-70℃可長期存放（裂解產(chǎn)物不能反復(fù)凍融）。
（2）將裂解產(chǎn)物 10000-15000 rpm 離心 3-5 min，離心后將上清液移入新的 EP 管中進(jìn)行后續(xù)檢測。
注：細(xì)胞裂解后可立即檢測，也可以凍存，需要時再檢測。凍存樣品需融解至室溫再進(jìn)行檢測。
2、工作液配制
（1）將所有組分恢復(fù)至室溫。
（2）用組分 B 充分溶解組分 C，配制成 0.2 mg/mL 的螢火蟲螢光素酶工作液。
注：螢火蟲螢光素酶工作液不能反復(fù)凍融，若單次實驗用量較少，建議按單次使用量分裝成小規(guī)格。
（3）用組分 D 將組分 E 稀釋成海腎螢光素酶工作液，稀釋方法為 1 ul E 組分加入到 49 µL D 組分中。
注：海腎螢光素酶工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配。
3、化學(xué)發(fā)光值檢測
（1）按照儀器操作說明書開啟具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的儀器，如多功能酶標(biāo)儀，設(shè)定參數(shù)，測定時間為 10 s，測定間隔為2 s。
（2）每個樣品測定時，取樣品 20-100 ul（如果樣品量足夠，請加入 100 ul；如果樣品量不足可適當(dāng)減少用量，但檢測孔用量需保持一致）。1×Lysis Buffer 為空白對照。
（3）加入 100 ul 螢火蟲螢光素酶檢測液，測定 RLU（relative light unit）值（建議酶標(biāo)儀設(shè)置 Shaking 混勻功能）。
注：由于該發(fā)光為瞬時發(fā)光，建議加入螢火蟲螢光素酶工作液后，立即進(jìn)行檢測。
（4）加入 100 ul 海腎螢光素酶工作液，測定 RLU（relative light unit）值（建議酶標(biāo)儀設(shè)置 Shaking 混勻功能）。
（5）在以海腎螢光素酶為內(nèi)參的情況下，用螢火蟲螢光素酶測定得到的 RLU 值除以海腎螢光素酶測定得到的 RLU 值。根據(jù)得到的比值來比較不同樣品間目的報告基因的激活程度。如果以螢火蟲螢光素酶為內(nèi)參，也可以進(jìn)行類似計算。

-20℃保存。C 組分建議預(yù)先使用無菌水配置為 2 mg/mL 儲液，B 組分、D 組分及配置為儲液的 C 組分，
根據(jù)實驗需求進(jìn)行小批量分裝。所有檢測工作液建議現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍融。

熒光素酶報告基因檢測試劑盒